上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
第六节 化学发光免疫分析
发光免疫测定采用化学发光物质作为标记物，根据发光原理的不同，可分为两类：化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）；酶增强发光免疫分析（enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay，ECLEA）。
一、化学发光免疫分析
1.原理
用化学发光物质标记抗体或抗原，标记的发光物质通过氧化反应获得能量，处于激发态，当返回基态时以光子的形式释放能量，其发光强度与被测物质浓度相关。
用于标记物的化学发光物质有：①氨基苯二酰肼类即异鲁米诺及其衍生物，如氨基己基乙基异鲁米诺（AHEI）、氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEI）、半琥珀酰胺、硫代异氰酸等；②吖啶酯类；③苯酚类化合物；④咪唑类；⑤芳基草酸脂类。
目前应用较为广泛的是吖啶酯类。吖啶酯（acridinium ester）是一种三环有机化合物，在碱性介质中易氧化，其氧化过程经历多价键的断裂，经过一个二氧化酮的中间体，产生一个电激发的10-甲基吖啶酮，当它回复到基态时在430nm处释放出光子。吖啶酯的特点是：①分子量小，因而对被标记物的空间位阻小；②发光反应快速而强烈，背景噪音低；③直接发光，无需酶催化，反应时间短，误差小；④受pH和温度影响小，检测精确度高；性质稳定，试剂保存期长。
现以Simense公司的Centaur检测系统为例加以说明。
2.试剂盒组成
（1）校准品：指用生物液或缓冲液配制的一组不同定值浓度的待测物质溶液，用于制作或校准原厂提供计量-反应曲线或用作cut off值校准。
（2）吖啶酯标记的抗原或抗体：由于在碱性条件下水溶液中存在有内源性过氧化物，可使发光化合物缓慢地失去活性，故标记物应保存于pH 7.0以下。
（3）抗体包被的顺磁性固相微粒是以三氧化二铁为核心的聚苯乙烯颗粒，直径1～2μm，特点是表面积大，可吸附大量抗体；均匀地悬浮在反应体系中，类似均相反应，可有效提高反应效率。
（4）试剂1：0.5% H 2O 2，0.1 N HNO 3。
（5）试剂2：<0.25N NaOH。
3.检测步骤
全部试验过程均在全自动化学发光免疫检测系统上，按预设程序自动完成，整个检测过程用时20分钟左右。步骤如下：
（1）待测标本或校正试剂 + 吖啶酯标记的抗原或抗体 + 顺磁性固相抗体；
（2）37℃温育一定时间；
（3）磁场作用于磁性微粒使之沉淀；
（4）吸去上清液，除去未与固相抗体结合的游离抗原和（或）抗体；
（5）洗涤磁性微粒2次；
（6）加入试剂1；
（7）加入试剂2，使吖啶酯氧化处于激发态后回复基态，并发出光子，整个过程在1秒内完成；
（8）ACS：180的光度检测系统读取发光强度，并经数据处理计算待测物质浓度。
4.注意事项
（1）应严格按照仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。
（2）固相微粒保存于缓冲液中，易沉淀，应在加样过程中持续旋转混匀，避免加样不均。混匀时注意不可产生泡沫。
（3）为使本底降到理想水平，除采用纯化学试剂外，应使用Ω≥1000kΩ的去离子水。
二、酶促发光免疫分析
1.原理
ECLEA是将化学发光物质作为酶的发光底物，由酶触发化学发光物质激发过程，产生光子。通过酶标抗原或抗体间的竞争性或非竞争性免疫结合反应，形成酶标复合物，再加化学发光底物，经酶促反应发光。其发光持续时间可长达30分钟以上，加之发光强度也明显提高，改善了信噪比，提高了灵敏度。目前常用的ECLEA系统有两种：
（1）辣根过氧化物酶-H 2O 2-鲁米诺-增强剂系统：
在此系统中辣根过氧化物酶（HRP）可使H 2O 2产生新生O 2作用于鲁米诺，形成激发态中间体，并分解发光，经增强剂（如对位碘酚、对位苯基酚）作用，可使发光时间延续30分钟以上，信号强度增加1000倍以上。
（2）碱性磷酸酶-环1，2-二氧乙烷衍生物系统：
常用的发光底物为金刚烷基1，2-二氧乙烷磷酸盐以及3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-环二氧乙烷，简称AMPPD。AMPPD经酶解去除芳香基团上的一个磷酸基，得到中等“稳定”的中间体AMPPD—（半衰期2～30分钟），并进一步裂解为金刚烷酮和激发态的间氧苯甲酯阴离子，当其跃迁回到基态时产生光子（波长470nm）。AMPPD在碱性和热环境下稳定性好，故本底低，pH 7.0时，室温下分解半衰期长，pH 9.5时酶解速度快，发光持续15～60分钟，光强度稳定，在0.1%BSA的反应液中发光强度明显增强。
现以OCD公司的Vitros ECI仪器为例加以说明。
2.试剂盒组成
（1）校正试剂：
指用生物液或缓冲液配制的一组不同定值浓度的待测物质溶液，用于制作或校准原厂家提供的计量-反应曲线或用作cut off值校准。
（2）碱性磷酸酶（AP）标记抗体或抗原：
要求标记物稳定不失活。4℃可保存数月。
（3）Test unit：
为盛有抗体包被小珠的测试杯，兼作离心管用，在10 000转/秒的离心作用下，清洗包被珠并将洗涤液排出到测试杯的外圈夹层中，为公司的专利。
（4）发光底物。
3.检测步骤：
全部试验过程均在IMMULITE全自动化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成，用时约50分钟（一步法）或80分钟（二步法）。以一步法为例，检测步骤如下：
（1）依次在test unit中加入待测标本或校正试剂+AP标记的抗原或抗体。
（2）37℃温育30～60分钟。
（3）高速离心除去未结合抗原或抗体。
（4）离心洗涤3次。
（5）加入发光底物，反应10分钟。
（6）用光量子检测系统，读取发光强度并经数据处理计算待测物的浓度。
4.注意事项
（1）由于酶本身的活性问题，导致定标频率高，标本中的某些组分也会对ALP活性有影响。
（2）发光底物不易溶解，有背景噪音，不稳定。
（3）系统对运行环境要求较高，应严格控制室内温度和湿度。
（4）所有定标液、质控液、标本和test unit在操作前必须在20～25℃，试剂和标本应充分混匀。