
2.1 植物转基因技术与转基因植物
植物转基因技术又称植物基因工程,也称重组脱氧核糖核酸(DNA)技术,是指通过物理的、化学的或生物学的方法,将外源目的基因与载体结合形成重组DNA分子,导入受体植物细胞中,并获得再生植株的转基因技术。植物转基因技术是在植物种类上的转基因操作,用于创造植物新类型或赋予植物新性状。运用植物转基因技术产生的植物新类型或获得转化的植物及其后代,称为转基因植物。
转基因植物目前主要应用于农业和医药领域。农业领域主要是利用组织培养技术和基因重组技术,向农作物转入其他生物或物种的各种有用基因,特别是抗有害生物(病原体、害虫、杂草等)、抗逆境(干旱、盐碱、寒冷、炎热等)、增进农产品产量和品质、改变生长发育特性、提高光和效率等方面的基因,获得符合人类目标的新种质,培育新品种。转基因作物在抗除草剂性、抗病性、抗虫性等方面的研究取得了突破性进展,在抗旱性、改善产品品质、高能生物燃料等方面也取得了一定的成绩。医药领域主要是利用转基因植物为“植物生物反应器”,生产口服疫苗及医用蛋白等。
植物转基因技术产业化是指以植物转基因技术发明或成果为依托,以技术转化与应用为目标,以市场机制为导向,形成完整植物转基因技术体系、产品体系、组织管理体系、质量控制系统,实行集约化生产、专业化分工、规模化经营、企业化管理,集研究、开发、生产、经营、服务于一体,以提高经济效益为目的的植物转基因技术产业的实现过程。植物转基因技术产业化是植物转基因技术与农业经济全过程结合的经营活动,其最重要的特点是成果的研制、开发、生产和营销的一体化经营,使农业生物技术的研制者与农业生产的经营者形成利益整体。
2.1.1 植物转基因技术:目的基因、载体与受体
植物转基因技术应用的目的基因分别从微生物、植物、动物甚至人类分离出来,目前国内外已经复制和鉴定的有100种以上。其中,最常见的有种子贮藏蛋白基因、抗除草剂基因、抗病毒基因和抗虫基因等。
种子贮藏蛋白基因中,研究得较深入的有玉米、小麦的醇溶蛋白基因,水稻的谷蛋白基因,马铃薯的块茎蛋白基因等。导入这些基因可望提高某些植物种子或储藏器官的蛋白质含量,或者改善蛋白质的氨基酸组成,以提高作物的营养品质。
抗除草剂基因至少有以下三类:第一类能改变植物酶对除草剂的敏感性。例如,“avoA突变基因”,它合成的EPSP酶中,脯氨酸被丝氨酸取代,酶的活力不受影响,但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%,从而使植物对除草剂表现不敏感。第二类能解除除草剂对植物酶的抑制。例如,“Bar基因”,它能合成乙酰转移酶,解除选择性除草剂对植物谷氨酰胺酶的抑制,避免植物细胞因为氨的积累毒害而死亡。目前这个基因已被导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物,其中转基因马铃薯已进行大田试验,并取得良好效果。第三类能补偿被除草剂破坏的植物酶。例如,经过修饰的EPSP酶基因,它表达的酶大幅度增加,以致草甘膦的浓度不足以破坏植物体内所有的EPSP酶,植物因此免于死亡。目前已将这种修饰过的基因导入烟草和矮牵牛,并产生了抗性。
抗病毒基因主要有以下几类:首先,目前主要利用病毒蛋白外壳基因,导入这类基因获得了抗烟草花叶病毒的番茄、抗黄瓜花叶病毒的烟草和番茄、抗马铃薯X或Y病毒的马铃薯、抗苜蓿花叶病毒的苜蓿、抗大豆花叶病毒的大豆、抗番木瓜环斑花叶病毒的番木瓜等,其中不少已进入大田试验。其次,利用反义核糖核酸(RNA),也就是将病毒基因反向接在强启动子后面,产生的大量反义RNA能封闭复制酶的结合位点,阻止病毒繁殖。但是这方面还需要进一步研究,因为目前表达的反义RNA量还未达到所需要的水平。最后,期望利用抗体基因的产物,使病毒的复制酶失效,这类工作还处于试验阶段。
抗虫基因主要有以下两类:一类是毒蛋白基因。例如,苏云金杆菌的Bt基因,它表达的晶体蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫有毒杀作用。毒蛋白在昆虫消化道内经过蛋白酶激活后造成消化道损伤而导致昆虫死亡,对其他生物则没有任何危害。目前Bt基因已被导入烟草、番茄、马铃薯、棉花、玉米、大豆等,并取得明显效果。今后还需要研究如何提高毒蛋白表达量,研究在毒杀害虫的同时如何保护益虫等。另一类抗虫基因是蛋白酶抑制基因,它的产物能干扰害虫体内蛋白酶的活性,阻碍对食物的消化而使害虫致死,杀虫作用广泛。这类基因如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CPTI),已导入烟草等作物,并产生抗虫效果。
植物转基因技术应用的目的基因,除上述之外,还有能固定空气中游离氮转化为植物可利用氮素的固氮基因、具有抗菌作用的几丁质酶基因和毒肽基因、与抗盐碱关系密切的脯氨酸基因、与雄性不育有关的核酸酶基因、与果实成熟有关的ACC合成酶基因,甚至人类的干扰素基因、生长激素基因等。虽然目前它们还处于试验阶段,但具有十分诱人的应用前景。
用于装载目的基因的载体,应用最多的是细菌中发现的一种小型环状DNA质粒,它被某种酶切开后能够嵌入装载具有目的基因的DNA片段。
为了便于在受体中检测到载体的存在,通常需要选用具有特殊遗传标记的质粒。目前植物转基因技术常用的遗传标记有以下几种:第一种是抗生素的抗性基因,如Cat基因可使植物细胞表现抗氯霉素。第二种是GUS基因,它可以使植物细胞在X-gluc底物溶液中显示蓝色。第三种是荧光素酶基因,可以使植物细胞发出蓝绿色荧光。植物转基因技术还有一些可望利用的潜在质粒。例如,Ri质粒可以诱导植物细胞产生根,这个根的细胞能分化形成植株。又如,酵母人工染色体能装载巨大的DNA片段,已用于动物基因工程,有望在不久的将来用于植物基因工程。
受体是重要的目标。植物转基因技术往往需要先将目的基因导入受体植物的离体单细胞,然后使单细胞分化发育成为转基因植株。这首先是因为高等植物与单细胞的微生物不同,前者是高度分化的多细胞有机体,很多情况下只有部分细胞接受目的基因,形成“嵌合体”。其次,与动物细胞不同,植物细胞具有很强的全能性,在离体条件下容易分化发育成完整的植株。
因此,植物转基因技术一般有必要也有可能和组织培养相结合。作为组织培养的植物材料,多是原生质体或悬浮培养细胞。目前这种方法已经运用在许多植物中,并得到了转基因的植株,为大规模投入现实农业生产创造了条件。
2.1.2 植物转基因技术实现转化的方法
植物转基因技术实现转化的方法很多,并不断创新,发展了农杆菌介导法、基因枪介导法、电击穿孔法、病毒介导法、化学物质诱导法、脂质体法、花粉管通道法、显微注射法、离子束介导法和DNA浸泡法等转基因技术,但主要以农杆菌介导法、基因枪介导法为主。
农杆菌介导法又称为共培养法,是将农杆菌与植物细胞共同培养,用农杆菌含有目的基因的质粒去转化植物细胞。该方法通常是在含有适量抗生素的培养基上,筛选具有抗生素抗性标记的转化细胞,然后用特定培养基诱导这些细胞形成植株。这是目前最常用的方法,已获得转基因株的植物大多数采用这种方法。
基因枪介导法又称为高速微弹法,是用表面附着DNA分子(含目的基因)的金属微粒,经过加速装置,轰击植物细胞,将DNA直接射入植物带壁的细胞。这种方法不受受体种类限制,快速简便,但是设备昂贵。目前这种方法的转化率已达到8%~10%,还在研究如何进一步提高。
利用这些方法,国外已建立了大规模的转基因体系,如孟山都公司有200多人在室内从事植物基因的转化研究,每年得到几十万株转基因植株,以筛选特异性转基因材料。多基因聚合转化技术目前在烟草、大豆上已取得了成功,利用基因枪轰击转化获得了多个外源基因同时表达的转化植株。发达国家都致力于规模化转基因技术实现标准化、工厂化和流水线式转基因植物品种培育。多基因聚合转化技术研究,实现多个基因按照育种目标进行组装后同时导入一个受体中,有效地聚合多个有利基因,使多个性状得到改良。开展高效转化技术研究可以突破基因型限制,提高转化效率;实现了安全高效、多基因、规模化转基因育种技术的发展。
2.1.3 植物转基因育种研究新进展
自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以及1986年首批转基因植物被批准进入田间试验以来,迄今为止,全世界转基因植物研究至少涉及35个科的200多个种,有近50个国家对60余种转基因植物进行了总计30000次以上的转基因作物的田间试验。已有35个科120多个种植物转基因获得成功,30多个国家批准数千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类有40多种,包括水稻、玉米、马铃薯等作物;棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物;西红柿、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜、辣椒等蔬菜作物;苜蓿、白三叶草等牧草;苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果;矮牵牛、菊花、香石竹、兰花等花卉;杨树等造林树种。
性状主要包括5大类:除草剂抗性;农业有害生物抗性,如对病毒、细菌、昆虫、线虫和真菌的抗性;改善产品品质,如改变植物中的油分、淀粉、糖类、纤维素;改良农艺性状,如提高产量、增强非生物逆境(冷、旱、盐等)耐受能力;其他性状,如选择性标记、遗传限制等技术性性状、特殊用途转基因作物性状,如产生药用蛋白、生物能源等特殊性状。
田间试验转基因作物中比例最大的是抗除草剂作物,其次是抗虫、抗病转基因作物以及改善农艺性状,如降低化肥使用的转基因作物。
值得注意的是,新型转基因产品的研发速度加快转基因生物已经从抗病、虫和除草剂等第一代植保性状向抗逆、改良营养品质、改变代谢途径等第二、三代发展,同时具有2~3种复合性状的转基因生物研发迅速。以培育抗旱、抗寒、盐碱等非生物逆境作物为代表的转基因作物研发将成为未来生物技术产业发展的重要方向,以期突破水资源短缺和其他逆境条件等限制农业发展的“瓶颈”。发达国家争先开发第二代转基因作物,更加注重产品质量、消费者的需求及农作物的抗逆性,增加产品附加值及替代不可再生工业饲料的可再生饲料的“第二代”性状,如低植酸酶动物饲料、种子油分改良等。近年来,用于生产药用蛋白、酶制剂及用于能源的第三代转基因生物研发迅速,这些特殊用途的转基因植物开始进入田间试验。
我国设立的国家高技术研究发展计划、历年国家科技攻关计划以及经国务院批准,科技部、财政部联合于1999年正式实施的“国家转基因植物研究与产业化专项”使我国转基因植物的研究和开发取得了显著的进展,有些研究已经达到国际先进水平。据2011年国家生物技术学会统计,我国投入研究和开发的转基因植物达47种,涉及各类基因103种。近年来有近20种转基因植物进入了田间试验或环境释放阶段。