第四章　结核分枝杆菌的生理生化

【摘要】结核分枝杆菌为结核病的病原菌，深入了解结核分枝杆菌的生理生化特性，是预防控制结核病的基础。近1年来，国内学者在结核分枝杆菌抗原的免疫原性及抗原表位、毒力因子、持留以及耐药等方面取得了不少研究成果。

【关键词】结核分枝杆菌；免疫原性；抗原表位；毒力因子；持留感染；耐药

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）为缓慢生长菌，有分枝生长的倾向，由于细胞壁内含有大量的分枝菌酸，包围在肽聚糖的外面，而具有抗酸染色特性。MTB生理生化的特殊性，不仅使其在自然环境中具有较强的抵抗力，如在阴湿处能生存5个月以上；MTB还能通过多种逃逸机制而抵抗宿主细胞的杀伤。由此可见，深入研究MTB的生理生化特性，为更好地理解结核病的发病机制和防控提供有利的基础。

MTB的PE/PPE家族蛋白占结核分枝杆菌编码能力的10%，根据N末端保守的脯氨酸-谷氨酸（Pro-Glu）和脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸（Pro-Pro-Glu）序列的不同，可以分为PE和PPE两个亚家族。PE/PPE蛋白家族共有168个成员，其中PPE蛋白有69个。PPE家族在N端含有保守的110～180个氨基酸残基，C端序列和大小是可变的。PPE36属于PE/PPE蛋白家族成员，在非致病性的耻垢分枝杆菌中不含有PPE36同源基因，表明PPE蛋白在结核分枝杆菌致病性方面起重要的作用。王雪林等[1]将结核分枝杆菌PPE36蛋白异源表达于非致病性的耻垢分枝杆菌MC2155，利用该重组菌感染小鼠巨噬细胞，结果显示PPE36能够增加耻垢分枝杆菌在小鼠巨噬细胞内的生存能力，诱导细胞的坏死，增加TNF-α、IL-1β的表达，减少IL-6的表达。上述说明，PPE36表达于耻垢分枝杆菌之后能够促进细胞死亡，影响细胞因子分泌，增加在小鼠巨噬细胞内的持留。

随着基因组学、转录组学等技术发展，MTB潜伏感染相关的蛋白也逐步引起关注，部分潜伏期蛋白已被作为结核潜伏感染的诊断靶标或构建新型疫苗组分。韩怀钦等[2]应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌潜伏期Rv2623蛋白序列，PCR扩增基因，克隆到pET30b载体上，在大肠埃希菌BL21菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE及Western blot鉴定后，亲和层析法纯化蛋白。将重组Rv2623免疫C57BL/6小鼠，制备免疫小鼠脾细胞，ELISA检测上清液特异性IFN-γ含量，流式细胞术联合胞内因子染色法，分析脾细胞中分泌TNF-α+、IFN-γ+的多功能CD4+T细胞水平。结果显示，成功构建、表达并纯化得到31.7kDa的重组Rv2623蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。重组Rv2623蛋白免疫小鼠后，诱导其脾细胞分泌的特异性IFN-γ水平（121.9ρg/ml）高于PBS组（37.8ρg/ml），同时诱导高水平能分泌TNF-α+、IFN-γ+单阳或双阳的特异性多功能CD4+T细胞（P<0.05）。上述表明，结核分枝杆菌潜伏期蛋白Rv2623具有良好的免疫原性，并能诱导特异性免疫应答。

DNA的G-四链体（G-quadruplex，G4）是由富含串联重复的鸟嘌呤（guanine，G）的核酸序列折叠形成的四链体螺旋结构，目前认为其与基因表达调控和基因组稳定性有关。已有研究表明，MTB的espK（Rv3879c）是构成ESX-1分泌系统的一个重要元件，其蛋白序列具有串联重复的GTPITP氨基酸序列多态性。吕亮东等[3]经核酸序列比对分析，确定该氨基酸序列多态性区域对应的模板链上存在G4序列，且该G4序列仅存在于结核分枝杆菌复合群。通过比对结核分枝杆菌临床分离株espK基因的核酸序列，发现espK基因的高频G1573C突变位于G4序列。为研究该G4结构及基因表达调控功能，首先利用圆二色谱检测其核酸片段在钾离子存在条件下的光谱学特征，证实其可在体外形成具有顺式平行结构特征G4，同义点突变G4会使其结构稳定性下降。采用重叠聚合酶链反应（overlapping polymerase chain reaction，overlapping PCR）构建含有G4突变的espK表达质粒，获得重组表达菌株。通过实时定量PCR测定espK重组表达菌株中基因转录水平变化，发现同义点突变G4后，其基因转录水平比野生型espK重组菌株提升1.5倍（P<0.05）。此外，临床分离株中espK出现的高频率G1573C突变会破坏G4结构，但蛋白免疫印迹检测结果显示espK G1573C突变导致EspK蛋白表达水平上升。以上结果提示，espK的G4结构具有表达调控功能，该G4区域的序列多态性可能通过影响EspK表达水平来调节ESX-1分泌系统的活性。

分枝杆菌具有独特的细胞壁结构，单个细胞壁组分影响多种分枝杆菌表型，如菌落形态、毒力和对外界环境的应急能力。Li等[4]在耻垢分枝杆菌中异源表达了蛋白Rv2387的开放阅读框，发现表达了Rv2387的耻垢分枝杆菌的菌落形态和细胞壁脂质成分与野生型不同，抗酸能力显著降低。该研究表明，Rv2387可以重塑细胞壁的结构，在分枝杆菌生理学中起重要作用。

结核病诊断缺乏有效特异方法是其防控的主要问题之一。血清学诊断由于简便、快捷、成本低、灵敏性和特异性较高，广泛用于结核病的早期诊断。李传友带领的团队[5，6]使用蛋白质组微阵列方法对健康对照（HC）、潜伏结核病感染（LTBI）和活动性肺结核（TB）中几乎所有MTB抗原的IgG和IgM抗体的血清谱进行了研究，并用ELISA方法对其不同的抗原进行验证，发现联合应用抗原Rv2026c和Rv2421c做为活动性TB诊断的灵敏度和特异性分别为82.5%和88.12%。ROC分析显示，抗原Rv2031c、Rv1408和Rv2421c的曲线下面积（AUCs）分别为0.8520、0.8152和0.7970，几种抗原有可能是LTBI和活跃的TB之间鉴别的血清生物标志物。罗巧等[7]克隆表达和纯化了蛋白Rv0432、Rv0674、Rvl566c、Rvl547-1和Rvl547-2，各重组抗原用ELISA对151份待检血清（41份健康组血清和110份细菌学阳性结核患者组血清）进行IgG抗体检测。结果显示，Rv0432、Rv0674、Rvl566c、Rvl547-1和Rvl547-2的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数和曲线下面积分别为43.64%～92.73%、80.49%～92.68%、0.92～0.94、0.38～0.80、0.363～0.732和0.649～0.915。目的蛋白在结核组检测到的IgG抗体水平均大于健康组（P<0.0001）。上述说明，结核分枝杆菌新抗原Rv0432、Rv0674、Rvl566c、Rvl547-1和Rvl547-2具有良好的血清学检测价值，可作为结核病免疫学诊断的候选抗原。

H37Rv基因组中大量未知基因包括毒力相关基因的功能仍未被阐明。近年来在MTB的基因组中研究发现，位于RD-7区相对分子质量为9900的Rv2346c（EsxO），其结构特性与6000早期分泌型抗原靶点Esat-6十分相近，也属于Esat-6基因家族，但有关其在结核分枝杆菌致病过程中所起的作用尚不清楚。冯旰珠等[8]利用分枝杆菌噬菌体重组系统成功构建结核分枝杆菌Rv2346c基因敲除株，分别用野生株和敲除株体内感染小鼠6～8周，敲除株感染小鼠肺组织后，体外菌落形成数明显低于野生株感染[（15.0±0.8）vs.（90.0±1.5），t=23.0361，P<0.05]，小鼠肺组织炎性反应程度明显轻于野生株感染[（1040±89）vs.（1960±56），t=7.1016，P<0.05]，其小鼠总死亡率明显低于野生株感染（53%vs.20%，χ2=6.1112，P<0.05）。研究说明，成功构建了噬菌体介导的结核分枝杆菌Rv2346c基因敲除株，为Rv2346c基因功能的研究奠定了基础。

基因组比较显示，RD区（region of deletion）是BCG基因组中相对于MTB标准株H37Rv或部分牛型分枝杆菌发生缺失的区域，BCG缺失了RD1～16区域，共129个开放阅读框架，编码129个蛋白，其中RD1～2区研究较多。关于结核RD区基因对MTB侵入巨噬细胞的影响尚不清楚。章晓联等[9]将H37RvRD 10～16区的18个MTB基因构建到pMV261载体上，然后将重组pMV261质粒电转至耻垢分枝杆菌M.smegmatis（Ms）中，并将各重组菌株命名为rMs∶Rvs。运用菌落计数法筛选功能性基因；采用流式细胞术Flowcytometry（FCM）、动物实验验证该基因的功能。结果显示，菌落计数显示rMs∶Rv1773c组菌落数最多，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。FCM验证Rv1773c促进Ms入侵巨噬细胞能力较强，rMs∶Rv1773c组感染小鼠脾脏菌落数增多。研究说明，筛选的RD14区功能性结核基因Rv1773c可能作为结核菌毒力因子，具备促进分枝杆菌入侵巨噬细胞的功能。

MTB是一种包含大量毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin systems，TAS）的病原体，但其中大部分TAS的功能作用尚不清楚。毒素-抗毒素（TA）系统在外环境压力条件下，有利于细菌存活的遗传原件。张俊杰等[10]发现并证实了一种新的结核分枝杆菌H37Rv的TA系统命名为mt-PemIK。此系统由抗毒素mt-PemI和毒素mt-PemK（Rv3098A）组成。通过诱导表达毒素mt-PemK使耻垢分枝杆菌生长停滞，当同时表达毒素mt-PemK和抗毒素mt-PemI时，mt-PemK的毒性被中和。mt-PemK具有pH依赖性的核糖核酸内切酶活性。mt-PemK和结核分枝杆菌其他的毒素-抗毒素蛋白一样可以被泛素化修饰，说明泛素化-蛋白酶体系统参与了TA系统的条件。这些研究结果有助于了解在应激条件下，结核分枝杆菌的生长调节机制。

细菌TA系统在调控细胞生理功能和抗生素靶标的筛选中发挥着重要作用。Xie等[11]对MTB的未知毒素基因Rv2872的功能进行研究，在耻垢分枝杆菌（MS　Rv2872）中异源表达该基因，经过诱导表型与对照不同，如万古霉素抗性增加，生长速率变慢，细胞壁和生物膜结构也发生改变。由于纯化的Rv2872毒素蛋白可以切割参与上述表型的几种关键基因，所以这种表型改变可能是由Rv2872的RNase活性引起的。总之，本研究首次报道了毒素Rv2872参与抗生素应激反应，细胞壁结构和生物膜发育的核酸内切酶活性。

MprAB和PhoPR是结核分枝杆菌中重要的双组分系统（TCS），MprAB和PhoPR对EspR（ESX-1分泌系统的关键调节因子）均具有调节作用。虽然过去研究表明，调节因子PhoP不直接调节mprA，但MprAB和PhoPR之间的相互作用仍不清楚。Cao等[12]发现调节因子MprA可以与phoP启动子结合，启动子有两个预测的结合位点，含有4个重复序列D1～D4，D1～D4不含有已经报道的MprA结合保守序列，表明MprA可以识别更大范围的靶位点。D1～D2与先前报道的PhoP结合位点重叠，D1～D2的突变抑制与PhoP结合，而D3～D4位点是MprA结合所必需的。EMSA测定还表明MprA和PhoP竞争结合到phoP启动子区域，在转录水平和蛋白表达水平MprA正向调控phoP的表达，进而上调espR的表达。这些发现揭示了双重TCS对分枝杆菌主要TCS的复杂调节。

MTB的显著特征是能够适应缺氧环境并进入休眠状态引起持续性感染，但MTB的缺氧反应如何受到调节仍然是个未知说。戈宝学等[13]在有氧和缺氧条件下，对MTB蛋白的乙酰化进行了定量分析：在缺氧条件下，MTB的269个蛋白中377个乙酰化位点发生了显著变化，特别是DosR在K182位点的去乙酰化增强其调控靶基因的转录表达，与DosRK182Q蛋白相比，DosRK182R蛋白的DNA结合活性增强。Rv0998是乙酰转移酶，催化DosR K182位点的乙酰化。用野生型MTB菌株和含有乙酰化缺陷的DosRK182R的MTB菌株分别感染小鼠，后者感染的小鼠组织病理学损伤较轻，细菌计数较少。研究结果表明，缺氧会诱导DosR的去乙酰化，从而增加其DNA结合促进靶基因的转录，使MTB由缺氧条件下转变为休眠状态。

对缺氧环境的适应在MTB持续感染中发挥着重要作用，但细菌从有氧状态到缺氧状态的转变是如何调控的尚不清楚。Rv0081是DosR调节子的成员，在缺氧的早期诱导，而Rv3334是持久的缺氧反应基因之一。Sun等[14]揭示了这两种转录因子之间的相互作用，RNA-seq分析显示ΔRv0081和ΔRv3334这两种突变体的基因表达谱高度相似。在缺氧条件下，Rv0081正向调节Rv3334的表达，而Rv3334抑制Rv0081的转录，Rv0081形成二聚体并与Rv3334的启动子区域结合。总之，这些数据表明Rv0081和Rv3334在相同的调节途径中起作用，Rv3334是持久缺氧反应基因的真正调节因子。

环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种细菌胞内的二级信使，通过调节胞内多种重要代谢途径，在细菌不同生长阶段发挥作用。c-di-GMP具有多种功能，如生物膜的形成和免疫调节等。同时，在慢生长MTB中c-di-GMP也发挥着调控休眠和毒力的作用。方海红等[15]通过基因序列比对，在MTB减毒菌株H37Ra的基因组序列中检索到一个含编码GAF-GGEDF-EAL的基因，基因编号是MRA　1362（简写为Ral362）。该基因编码c-di-GMP的二鸟苷环化酶（DGC）负责合成Cdi-GMP。通过敲除合成酶基因Ral362获得基因敲除株△Ral362，结果显示△Ral362株于痰液管中培养26天时已形成较厚的皱褶生物膜，形成生物膜的速度明显快于野生株5天；转录谱基因芯片和定量RT-PCR结果也显示，△Ral362株中19个与休眠相关基因的表达水平下调并能通过基因回补和外源添加c-di-GMP所补偿；在快速厌氧模型中发现，迟缓期过后△Ral362株对氧气的消耗比野生株组要快12小时，且细菌处于不能恢复正常生长的休眠状态。实验结果说明，Ral362基因通过控制c-di-GMP的合成调控MTB感应缺氧或者氧化还原压力，一方面调控生物膜的发育，另一方面在缺氧条件下通过调控DosR调节子基因的表达来调节细菌的休眠。

MTB基因组存在着一组包含48个基因的休眠存活调节子（DosR），这48个基因编码的蛋白控制着结核潜伏期的生理过程。高小玲等[16]对休眠存活调节子蛋白Rv2029c的功能进行了研究，采用原核表达的技术构建pET30a-Rv2029c重组质粒，并导入大肠埃希菌中进行表达。结果显示，由于缺乏营养物质和氧气，空质粒组大肠埃希菌在6小时进入平台期，而携带有pET30a-Rv2029c的重组质粒能够促进大肠埃希菌突破生长界限，维持快速对数生长期长达10小时。结果表明，结核DosR蛋白Rv2029c能够促进大肠埃希菌生长，突破其生长界限，提高细菌应对低氧、营养物质缺乏等应激环境的能力，这可能与其在低氧环境下促进细菌的糖酵解能力有关。

使用抗生素的选择性压力是MTB耐药性相关的最重要风险因素之一。然而，在分子水平上潜在的耐药机制仍然部分不清楚。黄海荣等[17]对同一个耐多药患者的两个临床分离株（在治疗前和治疗后1年）的全基因组进行了测序，发现6个基因，包括Rv1026、nc0021、Rv2155c、Rv2437、Rv3696c以及Rv2764c和Rv2765之间的间隔区域出现的新的多态性位点。采用代谢组学方法分析发现，两种分离株之间存在明显的区别，共涉及175种代谢物，这些代谢产物主要参与氨基糖和核苷酸糖代谢、β-丙氨酸代谢、硫代谢和半乳糖代谢。治疗后MDR-TB菌株表现出对乙胺丁醇耐药性增加可能与遗传变异有关，这些变异影响了碳和能源相关的许多代谢物的合成。这可能是该分离株对乙胺丁醇抗性增加的主要因素。

近年来，随着生物、化学、软件开发领域的交叉发展，数据库的积累，越来越多的新型诊断方法开始走进临床诊断，尤其是蛋白标志物的诊断，其中高效液相色谱质谱法已经成为一种逐渐被认可的疾病标志物筛查方法。黎敬忠等[18]利用高效液相质谱非标记的方法（LC-MS）鉴定耐药结核分枝杆菌蛋白质类型，与临床敏感组相比，阿米卡星耐药组有856种差异性蛋白被发现，其中显著上调的有332种，明显下调的有524种；与临床敏感组相比，利福平耐药组有726种差异蛋白，其中有441种明显下调，285种明显上调。阿米卡星耐药组与利福平耐药组相比，有141种差异性蛋白被发现，其中下调67种，上调74种。结果表明，耐多药结核分枝杆菌与临床敏感结核分枝菌株在蛋白种类与表达水平存在明显差异。

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