第二节 单个细胞的制备
一、血液单个细胞的制备
血液是天然的单分散细胞悬液，血中的细胞成分在生理状态下呈单个分散的游离状态，因此，它是流式细胞技术最合适的样品。全血中主要含有白细胞、红细胞、血小板等有形成分，如果只需要对其中的某一种细胞进行临床流式细胞学检验，如淋巴细胞DNA检验就需要从全血标本中将淋巴细胞分离出来，因此，往往需要分离制备某种血液细胞的单细胞悬液。
（一）单个核细胞的制备
血液当中的单个核细胞（mononuclear cell）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte，MNC或MN），大多数情况下，由于血液中单核细胞的含量较少，因此常常将单个核细胞视为淋巴细胞。从全血中制备单个核细胞最常用、分离效果最好的方法是淋巴细胞分离液分离法，该法属于梯度密度离心技术。淋巴细胞分离液是一种分离量大、黏性强的液体，比重为1.077。在一定离心力的作用下，血液中的红细胞比重最大，将沉淀到管底；粒细胞比重较红细胞略低，将集中于红细胞表面；比重最轻的血浆浮于最上层，比重较轻的单个核细胞位于血浆层和分离液层之间，形成一层灰白色的薄层，于是很容易得到单个核细胞。
1.适用范围
用于流式分析的标准样品制备。由于其纯度较高，细胞形态、大小、DNA含量较为一致，常作为校正仪器CV值的一个较好的生物标准品；在肿瘤细胞DNA倍体分析中，也可作为DNA二倍体标准细胞。
2.制备方法
（1）取肝素抗凝血2ml，加入2ml的生理盐水进行对倍稀释。
（2）另取一支离心管，加入3ml人淋巴细胞分离液（该试剂目前已有商品化产品出售，也可以自行配制，具体配制方法参加附录Ⅱ）。左手以30°～45°倾斜手持试管，然后右手以吸管将稀释血液标本沿试管内壁缓缓加入试管内，使稀释血液标本叠加在分离液上。
（3）室温2 500r/min离心30分钟，可见试管内的血液清楚地分为4层，从上到下依次是血浆层、单个核细胞层（灰白色）、分离液层、粒细胞层和红细胞层（图3-1）。
（4）用吸管将单个核细胞层全部吸出，收集到另一支离心管内，加入10ml生理盐水，1 500r/min离心10分钟，去掉上清液。同法再洗涤细胞2次，收集沉淀物即为纯度较高的单个核细胞。
（5）如果不立即进行检验，用作DNA分析时，可以将单个核细胞悬液用预冷的70%乙醇固定，置4℃冰箱保存；用作细胞表面抗原检测时，可以将单个核细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，长期存放详见第四章第四节。
图3-1 淋巴细胞分离液分层
3.注意事项
（1）叠加稀释血液标本到分离液上时，向试管内加入稀释血液标本要轻而缓，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，得不到叠加效果。
（2）70%乙醇4℃冰箱保存一般不超过1周。
（3）乙醇固定可造成被固定细胞收缩，引起细胞表面抗原成分改变，因此不适合于细胞表面抗原分析用单个核细胞的保存。
（二）淋巴细胞的制备
1.适用范围
用于流式分析的标准样品制备。由于其纯度高，细胞形态、大小、DNA含量一致，常作为校正仪器CV值的生物标准品，以及DNA二倍体标准细胞。
2.制备方法
（1）采用淋巴细胞分离液法首先制备单个核细胞。
（2）将收集的单个核细胞以生理盐水稀释至8～10ml体积，倾入直径8cm的玻璃平皿中，加盖后放入37℃温箱中，静置30分钟，让单核细胞贴附于玻璃上，收集未贴附的细胞悬液。
（3）室温，1 500r/min离心5分钟，去上清液。
（4）打散细胞沉淀，如不及时检验，用作DNA分析时，可以将淋巴细胞用预冷的70%乙醇固定，置4℃冰箱保存；用作细胞表面抗原检测时，可以将淋巴细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，长期存放详见第四章。
3.注意事项
（1）静置后收集未贴附的细胞悬液时，手法要轻，以免贴附于玻璃上的单核细胞发生脱落。同时，也需要轻轻加入吹打，将静置沉淀于玻璃上的淋巴细胞悬浮起来。
（2）70%乙醇4℃冰箱保存一般不超过1周。
（3）乙醇固定可造成被固定细胞收缩，引起细胞表面抗原成分改变，因此不适合于细胞表面抗原分析用单个核细胞的保存。
（三）单核细胞的制备
单核细胞具有玻片贴附能力，而淋巴细胞及其他粒细胞在短时间内无贴附能力，利用单核细胞的这一特性，就可以分离获得较纯的单核细胞。
1.适用范围
用于流式分析的标准样品制备。由于其纯度高，细胞形态、大小、DNA含量一致，是校正仪器CV值的常用生物标准品，以及DNA二倍体标准细胞。
2.制备方法
（1）取肝素（1 000U/ml）抗凝血3ml，加入3ml生理盐水，混匀。
（2）取培养瓶1支，加入RPMI 1640培养液10ml，再将稀释血液标本加入培养液中，混匀。
（3）将加好培养液和血液标本的培养瓶放入37℃恒温箱内，孵育30～40分钟。
（4）取出培养瓶，将瓶内血液倒掉，用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次，以去掉残留的血液。这时培养瓶壁上贴附了大量的单核细胞。
（5）加入0.25%胰酶少许，室温环境中平放培养瓶10～15分钟，期间不时摇震培养瓶，将贴附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来。
（6）收集消化液（内含脱落下来的单核细胞）于离心管中，1 000r/min离心5分钟，去掉上清液，再以生理盐水洗涤细胞沉淀2～3次，以除去细胞碎片。
（7）取少量细胞沉淀物涂片，吖啶橙染色，置荧光显微镜下观察形态和纯度。
（8）如不即刻进行检验，用于DNA分析时，可将细胞沉淀物打散，用70%的冰冷乙醇固定，置4℃冰箱保存；用于细胞表面抗原成分分析时，可以将细胞沉淀物打散，悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存可详见第四章。
3.注意事项
（1）培养瓶要选择大号的，使血液标本与培养瓶接触面要大，便于单核细胞贴附于培养瓶的玻璃表面上。
（2）从培养瓶壁上将单核细胞消化下来时，由于单核细胞的贴附能力很强，酶消化往往获得细胞数少。因此，可用一橡皮刷伸入培养瓶，在瓶壁上轻擦，将细胞刮下来，但切勿用力过大，造成细胞损伤过多。
（3）70%乙醇4℃冰箱保存一般不超过1周。
（4）乙醇固定可造成被固定细胞收缩，引起细胞表面抗原成分改变，因此不适合于细胞表面抗原分析用单个核细胞的保存。
二、骨髓单个细胞的制备
1.适用范围
制备不含较大的红细胞和红母细胞的骨髓单细胞悬液。
2.制备方法
（1）按照无菌骨穿技术要求，抽吸骨髓0.5ml。
（2）将抽吸的骨髓标本一滴一滴地加入肝素（1 000U/ml）抗凝的2.0ml PBS液中，再补充PBS液至10ml，混匀。
（3）另取1支10ml规格试管，预先加入4.0ml人淋巴细胞分离液。
（4）左手以30°～45°倾斜手持试管，然后右手以吸管吸取5ml稀释骨髓标本，将稀释骨髓标本沿试管内壁缓慢加入试管内，使稀释骨髓标本叠加在人淋巴细胞分离液上。
（5）室温4 000r/min离心15分钟，将淋巴细胞、单核细胞、髓性细胞、白血病细胞与较大的红细胞、红母细胞在PBS-人淋巴细胞分离液中形成一个界面。
（6）吸去界面下的红细胞和红母细胞。
（7）室温1 000r/min离心5分钟，去上清液。
（8）加入8ml PBS重悬细胞沉淀，室温1 000r/min离心5分钟，去上清液。再同法重复洗涤1次。
（9）收获的细胞沉淀即可进行荧光染色和流式分析。
3.注意事项
将抽吸的骨髓标本加入肝素-PBS液时，一定要一滴一滴地加入，并且要求边加边摇试管，使加入的骨髓标本及时与肝素抗凝的PBS混匀，防止形成大的细胞团块。
三、脱落细胞单个细胞的制备
在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经过简单的处理，就可以得到较好的单分散的细胞悬液用于临床流式细胞学检验。以下介绍关于胸腔积液、腹水、各种灌洗液及内镜刷检标本等脱落细胞样品的单细胞悬液制备。
（一）胸腔积液、腹水脱落细胞的制备
1.取紫头管（内含EDTA-K2抗凝）盛放的胸腔积液、腹水20～30ml，室温，1 500r/min离心5分钟，去上清液。
2.加入5～6ml的生理盐水重悬沉淀物，室温，1 000r/min离心5分钟，去上清液。
3.按步骤2相同的方法再洗涤沉淀物1次。
4.用预冷的5ml PBS重悬沉淀物，室温放置20分钟，用300目筛网过滤，收集滤过物（单个分散的脱落细胞）。
5.按照步骤2的方法，以生理盐水洗去脱落细胞中的PBS，将最后一次离心得到的细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液。
6.如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章第四节。
（二）宫颈脱落细胞的制备
1.首先用生理盐水冲洗患者的子宫颈表面，将表面分泌物洗去。
2.以海绵轻拭宫颈表面，将海绵中吸附的脱落细胞洗脱到20ml生理盐水中。
3.室温，1 500r/min离心5分钟，收集细胞沉淀，再以生理盐水洗涤1次。
4.加入5ml的生理盐水，用300目滤网过滤，收集滤过物（单个分散的脱落细胞）。
5.室温，1 500r/min离心5分钟，去上清液，沉淀打散即为制备好的单细胞悬液。
6.如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（三）食管脱落细胞的制备
1.将食管拉网器上的细胞洗脱到20ml生理盐水中。
2.在室温下，1 500r/min离心5分钟，收集细胞沉淀，再用生理盐水洗涤1次。
3.加入5ml的生理盐水，以300目滤网过滤，收集滤过物（单个分散的脱落细胞）。
4.在室温下，1 500r/min离心5分钟，去上清液，将离心沉淀打散即为制备好的单细胞悬液。
5.如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（四）内镜刷检样品脱落细胞的制备
包括食管镜、胃镜、支气管镜、膀胱镜等刷检样品。
1.将刷检的毛刷放入10ml盐水中洗脱，收集悬液。
2.在室温下，1 500r/m离心5分钟，收集细胞沉淀，再用生理盐水洗涤1次。
3.加入5ml的生理盐水，以300目滤网过滤，收集滤过物（单个分散的脱落细胞）。
4.在室温下，1 500r/min离心5分钟，去上清液，将离心沉淀打散即为制备好的单细胞悬液。
5.如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（五）灌洗液脱落细胞的制备
包括肺、胃、膀胱冲洗液等。
1.收集灌洗液20～30ml，室温，1 500r/min离心5分钟，收集细胞沉淀。
2.加入5～6ml的生理盐水重悬沉淀物，室温，1 000r/min离心5分钟，去上清液。
3.按照步骤2的方法，以生理盐水洗涤沉淀物1次。
4.加入5ml的生理盐水，以300目滤网过滤，收集滤过物（单个分散的脱落细胞）。
5.在室温下，1 000r/min离心5分钟，去上清液，将离心沉淀打散即为制备好的单细胞悬液。
6.如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
四、实体瘤组织单个细胞的制备
（一）机械法制备实体瘤组织单细胞悬液
1.适用范围
从软组织块中制备单细胞悬液，如淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌及一些软组织肉瘤等。
2.制备方法
（1）剪碎法：
①将组织块放入平皿，加入少量盐水，以剪刀将组织剪至匀浆状；②加入10ml生理盐水，用吸管吸取组织匀浆，用100目滤网过滤去除块状未剪碎组织，收集滤过物到试管内；③室温，1 500r/min离心5分钟，去上清液；④加入5～6ml生理盐水重悬沉淀物，1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤1次；⑤加入5～6ml生理盐水，再以300目滤网第二次过滤，去除细胞团块；⑥1 000r/min离心5分钟，去上清液，将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液；⑦如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章第四节。
（2）网搓法：
①将100目、300目滤网扎在小烧杯上；②把剪碎的组织放到网上，以眼科镊子夹住组织块在网上反复地搓，边搓边以生理盐水冲洗，直到组织搓完；③收集细胞悬液，1 000r/min离心5分钟，去上清液；④将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液，如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（3）研磨法：
①取1支70ml规格的组织研磨器，将组织剪碎成小块后放入组织研磨器中；②加入1～2ml的生理盐水，转动研棒，研至匀浆；③加入10ml的生理盐水，将组织匀浆稀释并收集到试管中；④再加入10ml的生理盐水，冲洗组织研磨器中残留的细胞，并将冲洗液回收到试管内；⑤用300目滤网过滤，收集滤过液，室温1 000r/min离心5分钟，去上清液；⑥加入5～6ml生理盐水重悬沉淀物，1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤1次；⑦将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液，如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。可将其加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检。
3.注意事项
（1）机械法主要给予组织较大的压力，使细胞从组织间释放出来，这种方法对细胞损伤大，细胞碎片多，细胞团块多。
（2）不适合于从硬组织或纤维组织中分离制备单细胞悬液。
（二）酶法制备实体瘤组织单细胞悬液
1.胰蛋白酶消化法
（1）适用范围：
用于从间质较少的组织中分离制备单细胞悬液，如上皮组织、肝组织、肾组织等。
（2）制备方法：
①将手术切除的组织立即放入冰冷的组织培养液（也可使用无钙、镁离子的PBS液或生理盐水）中，将组织块上的坏死成分、纤维、脂肪成分及一些可见的血管组织除去；②取出组织块并置于平皿中，用眼科剪将组织块剪成1.0mm大小的小块；③按照1g组织加入10ml的比例，加入胰蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶，pH为8.0），转入三角烧瓶中；④37℃水浴箱中消化20～40分钟，每间隔5～10分钟振荡1次；⑤终止消化，收集细胞悬液，以100目滤网过滤，除去大团块；⑥收集滤过液，室温1 000r/min离心5分钟，去上清液；⑦加入5～6ml生理盐水重悬沉淀物，1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤1次；⑧将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液，如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（3）注意事项：
①钙离子、镁离子、血清等对消化反应有抑制作用，消化过程中使用的液体试剂均不能含有这些物质。②消化时间根据组织的不同有一定调整，如果温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度较低，则消化时间相对较长。新配制的胰蛋白酶消化液消化能力较强，消化时间需要适当缩短。③向胰蛋白酶消化液中加入适量的EDTA（详见化学法制备实体瘤组织单细胞悬液），可以提高消化效率。
2.胶原酶消化法
（1）适用范围：
用于从纤维组织、上皮、癌组织中分离制备单细胞悬液，如食管癌、乳癌、皮肤癌等。
（2）制备方法：
①将手术切除的组织置于平皿中，用眼科剪将组织块剪成1.0mm大小的小块；②按照1g组织加入10ml的比例，加入胶原酶消化液（0.1～0.3μg/ml或200U/ml），转入三角烧瓶中；③37℃水浴箱中消化5～48小时，每间隔5～10分钟振荡1次；④终止消化，收集细胞悬液，以100目滤网过滤，除去大团块；⑤收集滤过液，室温1 000r/min离心5分钟，去上清液；⑥加入5～6ml生理盐水重悬沉淀物，1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤1次；⑦将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液，如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
（3）注意事项：
①钙、镁离子、血清等对消化反应没有影响，因此应尽量使用含血清细胞培养液配制胶原酶消化液，有助于提高细胞成活率；②消化过程中要多观察，当组织块的形状塌陷并呈现出松散，摇动三角烧瓶可见到细胞团散开的现象，提示消化可以终止。
（三）酶化学法制备实体瘤组织单细胞悬液
单纯使用酶消化法或化学法往往效果不是非常理想，现实工作中常常将酶消化法和化学法联合使用，即酶化学法。最常用的酶化学法即胰蛋白酶-EDTA螯合法，现介绍如下。
1.适用范围
从间质较少的组织中制备单细胞悬液，如上皮、肝、肾组织等。
2.主要试剂
（1）EDTA-Hank液：
称取EDTA 0.2mg，加入100ml的Hank’s液中，待彻底溶解后，高压消毒，置于4℃冰箱保存。
（2）0.25%的胰蛋白酶液：
称取胰蛋白酶0.25g，加入pH为8.0的PBS液100ml，搅拌使胰蛋白酶溶解。
（3）0.02%的EDTA液：
称取EDTA 0.02g，加入pH为7.0的PBS液100ml，搅拌使胰蛋白酶溶解。
（4）胰蛋白酶-EDTA液：
取0.25%的胰蛋白酶液和0.02%的EDTA液各40ml，混合均匀，分装后置冰箱保存，用时过滤即可使用。
3.制备方法
（1）将手术摘取的组织切为薄片并放入小三角烧瓶中。
（2）加入 EDTA-Hank’s液10ml，室温下30分钟，将上清液小心倒掉。
（3）加入胰蛋白酶-EDTA液10ml，37℃恒温水浴30分钟，间断振荡3～5次。
（4）用300目滤网过滤，收集滤过液，室温1 000r/min离心5分钟，去上清液。
（5）加入5～6ml生理盐水重悬细胞沉淀，1 000r/min离心5分钟，去上清液。重复洗涤1次。
（6）将细胞沉淀打散即为制备好的单细胞悬液，如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
4.注意事项
（1）手术切除肿瘤组织后，如不能马上做单细胞制备，可将组织块放入组织培养液中，并置于4℃冰箱中存放。
（2）应挑选新鲜无坏死的肿瘤组织制备单细胞悬液，制备前还需要将组织上的血液清洗干净。
（四）低渗组织液处理法制备实体瘤组织单细胞核悬液
该法采用低渗组织液造成细胞膜破裂，使细胞核溢出进入到悬液中，得到分散的单细胞核悬液，即从新鲜实体瘤组织直接脱核。
1.适用范围
用于对瘤细胞DNA含量及周期的检测。
2.主要试剂
（1）染色液：
溴化乙锭（EB）10mg，枸橼酸钠1.0g，NaCl 564mg，蒸馏水1 000ml。加入0.3ml的NP-40或10ml的 Triton-X 100。
（2）Tris缓冲液：
Tris 12.1g，EDTA-Na2 370mg，蒸馏水 900ml，以 1mol/L 的 HCl调 pH为7.4，用蒸馏水补足1 000ml。
（3）RNA酶-染色液：
称取RNA酶（50U/mg）1.0mg，加入100ml染色液。
3.制备方法
（1）取新鲜肿瘤组织0.5g，用眼科剪剪成1.0mm×1.0mm大小，放入10ml试管中。
（2）加入5ml的Tris缓冲液，漂洗1次。
（3）加入5～6ml的RNA酶-染色液，放入4℃冰箱12～24小时。
（4）用300目滤网过滤，收集滤过液，1 500r/min离心5分钟，去上清液。
（5）加入1ml的RNA酶-染色液复染30分钟，上机测定。如不马上测定，可将细胞加入预冷的70%乙醇中，放4℃冰箱保存备检。
4.注意事项
细胞核悬液可以改善样品的变异系数，本方法比较简便，易掌握，但应避免脱核时间过长，造成核膨胀或破裂。
五、石蜡包埋组织单个细胞的制备
石蜡包埋组织来源于临床病理检查，是医院重要的患者样品库。临床医学诊疗中，时常需要从石蜡包埋组织中制备单细胞悬液，用于各种医学信息采集，包括临床流式细胞学检验项目。
石蜡包埋组织单细胞悬液的制备时，首先需要脱蜡，即将石蜡包埋组织中的石蜡经二甲苯脱去，使组织形态重新恢复到甲醛固定前的状态；然后，采用从高到低的浓度梯度乙醇及蒸馏水，使组织逐步水化；最后，采用胃蛋白酶消化法消化组织细胞间的蛋白物质，使组织细胞分散，细胞核从组织切片上释放出来，得到单细胞核悬液。
（一）制备方法
1.切片 将石蜡包埋组织在切片机上切取40～50μm厚的组织切片3～5张。
2.脱蜡 将组织片放入试管中，加入二甲苯3～5ml，室温脱蜡1～2天。
3.水化 准备100%、95%、70%、50%浓度梯度的乙醇管，各盛放相应浓度的乙醇5ml，将切片依次放入其中并在每一个浓度梯度的乙醇管中停留10分钟，最后取出切片，放入到盛有5ml的蒸馏水的试管中，继续浸泡5分钟，倒掉蒸馏水。
4.消化 加入5ml的胃蛋白酶消化液（配制方法参见附录Ⅱ），置于37℃恒温水浴箱中，消化30分钟，期间每隔5～10分钟振荡1次。
5.加入生理盐水终止消化，收集消化液，用300目滤网过滤。
6.收集滤过液，1 500r/min离心5分钟，去上清液。
7.加入生理盐水5～6ml，1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤1次。
8.打散沉淀即为制备好的单细胞核悬液，如不立即检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检。
（二）注意事项
1.一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法：弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果没有絮状物浮起，即可视为石蜡已经脱净，反之则没有脱净。如果经过步骤2石蜡仍然未脱净，可换1次二甲苯继续脱蜡。
2.消化要完全，如果发现组织片未能消化完全，可做2次消化。但是消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉。
3.制备的单细胞核悬液质量可采用AO染色镜检法进行鉴别，具体的方法：取悬液做涂片、AO染色，在荧光显微镜下观察，质量好时应为完整的细胞核，核发出黄绿色荧光。
4.切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，流式检验时噪声增加，影响数据采集；过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长。一般以40～50μm为宜。
六、培养细胞单个细胞的制备
体外细胞定向诱导培养回输是临床某些疾病的治疗手段之一，回输前需要对定向诱导培养细胞的某些特性进行鉴别，是当今流式细胞技术中的一个新领域。因此，制备质量满意的培养细胞单细胞悬液十分重要。
（一）悬浮培养细胞的单细胞悬液制备
1.制备方法
（1）用吸管将细胞培养瓶中的细胞吹打混合均匀，收集培养液于离心管中。
（2）在室温下，800～1 000r/min离心5分钟，去上清液。
（3）加入预冷pH为7.4的PBS 5～6ml重悬细胞，800～1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤2～3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。
（4）打散细胞沉淀，即为制备好的单细胞悬液。如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
2.注意事项
（1）加入适量的PBS对细胞进行洗涤是必要的，可以去除死亡细胞碎片，减少其对流式检验结果采集的影响。
（2）70%乙醇4℃冰箱固定的细胞标本一般可以保存1周。
（3）乙醇固定在一定程度上可以引起细胞收缩，导致细胞表面抗原成分改变，因此不适合于保存细胞表面抗原检测的单细胞样品。
（二）贴壁培养细胞的单细胞悬液制备
1.制备方法
（1）向培养瓶加入0.04% EDTA-Na2或0.29%胰蛋白酶5～6ml，消化3～5分钟，弃掉消化液，另外加入Hank’s液5～6ml。
（2）用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。
（3）室温，800～1 000r/min离心5分钟，去上清液。
（4）加入预冷pH为7.4的PBS 5～6ml重悬细胞，800～1 000r/min离心5分钟，去上清液。同法重复洗涤2～3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。
（5）打散细胞沉淀，即为制备好的单细胞悬液。如不及时检验，用于DNA分析时，可将细胞加入70%的预冷乙醇中，冰箱4℃固定备检；用于细胞表面抗原成分检测时，可以将细胞悬浮于RPMI 1640细胞培养液中，4℃存放24小时，若需要长期保存详见第四章。
2.注意事项
（1）消化时间视室温的不同需要适当调整，一般室温偏高，消化时间短；室温偏低，消化时间长。判断是否需要停止消化的依据是，倒置显微镜下见到贴壁细胞之间出现筛状间隙为止。
（2）70%乙醇4℃冰箱固定的细胞标本一般可以保存1周。
（3）乙醇固定在一定程度上可以引起细胞收缩，导致细胞表面抗原成分改变，因此不适合于保存细胞表面抗原检测的单细胞样品。
（4）单细胞悬液的制备质量可以用溴化乙锭（EB）染色镜检法进行快速初步鉴定，具体的方法：取1滴制备的单细胞悬液，滴在清洁干燥的载玻片上，再滴加少量溴化乙锭染液，10分钟后，将玻片置于荧光显微镜下观察，如有细胞重叠成团现象，需用300目滤网对细胞悬液进行过滤，收集滤过液即为真正的单细胞悬液。
（5）合格的单细胞悬液要求死细胞数小于5%，以免影响流式检测结果。
（6）该法制备的单细胞不适合于采用Annexin Ⅴ-PI试剂盒作细胞早期凋亡分析，胰蛋白酶处理及后续细胞收集、清洗过程本身容易造成细胞凋亡发生。
（曾家伟 吴丽娟）